La electroforesis en gel de agarosa es una de las técnicas más utilizadas en los laboratorios de biología molecular. A través de la electroforesis podemos separar fragmentos de ADN y ARN en función de su tamaño y carga, visualizarlos mediante una sencilla tinción, y de esta forma determinar el contenido de ácidos nucleicos de una muestra.
¿Cómo se lleva a cabo la electroforesis en gel?
El gel poroso de agarosa se utiliza para separar las macromoléculas de diversos tamaños. El gel se sumerge en una solución tampón en una cámara de la electroforesis. La cámara tiene dos electrodos – uno positivo y otra negativo – en sus dos extremos.
Las muestras se cargan en pozos minúsculos en el gel con la ayuda de una pipeta. Una vez que se han cargado las muestras por completo, es aplicada la corriente electrica. Ahora, las moléculas cargadas presentes en la muestra comienzan a emigrar a través del gel hacia los electrodos. Las moléculas cargadas negativamente se mueven hacia el electrodo positivo y las moléculas cargadas positivamente emigran hacia el electrodo negativo.
La velocidad a la cual cada molécula viaja a través del gel se llama su movilidad electroforética y es determinada principal por su carga neta y talla. Las moléculas fuertemente cargadas mueven más rápidamente que débil cargados. Moléculas más pequeñas ejecutan más rápidamente irse detrás las más grandes. Así que, carga fuerte y tamaño pequeño aumentan la movilidad electroforética de una molécula, mientras que carga débil y gran tamaño disminuyen la movilidad de una molécula.
Cuando se ha completado la separación, el gel se colorea con un tinte para revelar las bandas de la separación. El bromuro de etidio es un tinte fluorescente de uso general en electroforesis del gel. El gel se empapa en una solución diluida del bromuro de etidio y después se coloca en un transilluminator ULTRAVIOLETA para visualizar las bandas de la separación. Las bandas se examinan o se fotografían inmediatamente para la referencia futura.
¿Qué es la purificación de proteínas?
La purificación de proteínas es una técnica de laboratorio que consiste en una serie de pasos, que tienen como objetivo aislar un solo tipo de proteína a partir de una mezcla compleja. Esta técnica es esencial para la caracterización de la función, estructura, e interacciones.
Por lo general el material de inicio es un tejido biológico o un cultivo microbiano. Esta purificación se lleva a cabo en una serie de etapas que se pueden resumir:
- Extraer a la proteína de la matriz que la confina
- Separar las partes proteicas y no proteicas de la mezcla
- Separar a la proteína deseada de las demás proteínas
Pasos para la purificación de una proteína
- Crear un extracto de proteína cruda: Los extractos crudos de proteínas intracelulares son preparados lisando las células, mediante procesos químicos o mecánicos. Las proteínas extracelulares son obtenidas centrifugando la solución y retirando las células.
- Purificación intermedia: Esta puede realizarse precipitando las proteínas con una sal altamente concentrada como por ejemplo el sulfato de amonio. Luego las sales de proteínas son pasadas a través de una membrana semipermeables en un paso conocido como diálisis o sometidas a cromatografía o filtración de la exclusión de gel.
- Purificación final: Esto se logra a través de una cromatografía de afinidad, electroforesis de gel de poliacrilamida o inmunoblotting.
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