La electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida es una de las metodologías más utilizadas en el laboratorio en todo lo relacionado con el trabajo con ácidos nucleicos. Mediante la electroforesis podemos separar fragmentos de ADN y ARN en función de su tamaño, visualizarlos mediante una sencilla tinción, y de esta forma determinar el contenido de ácidos nucleicos de una muestra, teniedo una estimación de su concentración.
La técnica de la electroforesis del gel utiliza la diferencia de tamaño y la carga de diversas moléculas en una muestra. La muestra de ADN, ARN o de la proteína que se separará se carga conectado a un gel poroso colocado en un ambiente iónico del almacenador intermedio. En el uso de la carga eléctrica, cada molécula que tiene diversas talla y carga se moverá a través del gel a diversas velocidades.
El gel poroso usado en esta técnica actúa como criba molecular que separa las moléculas más grandes de las más pequeñas. Moléculas más pequeñas se mueven más rápidamente a través del gel mientras que los más grandes se dejan detrás. La movilidad de las partículas también es controlada por su carga eléctrica individual.
¿Cómo se lleva a cabo la electroforesis en gel?
El gel usado en electroforesis del gel se hace generalmente de un material llamado la agarosa, que es una substancia gelatinosa extraída de alga marina, o también de poliacrilamida. Este gel poroso se puede utilizar para separar las macromoléculas de muchas diversas tallas. El gel se sumerge en una solución tampón en una cámara de la electroforesis. El Tris-borato-EDTA (TBE) es de uso general como el almacenador intermedio. Su función principal es controlar el pH del sistema. La cámara tiene dos electrodos – uno positivo y otra negativo – en sus dos extremos.
Las muestras que necesitan ser analizadas entonces se cargan en pozos minúsculos en el gel con la ayuda de una pipeta. Una vez que el cargar es completo, una corriente eléctrica de 50-150 V es aplicada. Ahora, las moléculas cargadas presentes en la muestra comienzan a emigrar a través del gel hacia los electrodos. Las moléculas cargadas se mueven hacia el electrodo positivo y positivo las moléculas cargadas emigran negativo hacia el electrodo negativo.
La velocidad a la cual cada molécula viaja a través del gel se llama su movilidad electroforética y es determinada principal por su carga neta y talla. Las moléculas fuertemente cargadas mueven más rápidamente que débil cargados. Moléculas más pequeñas ejecutan más rápidamente irse detrás las más grandes. Así que, carga fuerte y tamaño pequeño aumentan la movilidad electroforética de una molécula, mientras que carga débil y gran tamaño disminuyen la movilidad de una molécula.
Una vez que la separación es completa, el gel se colorea con un tinte para revelar las bandas de la separación. El bromuro de etidio es un tinte fluorescente de uso general en electroforesis del gel. El gel se empapa en una solución diluida del bromuro de etidio y después se coloca en un transilluminator ULTRAVIOLETA para visualizar las bandas de la separación. Las bandas se examinan o se fotografían inmediatamente para la referencia futura, pues difundirán en el gel en un cierto plazo.
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