Para la inclusión de muestras histológicas que han de observarse con el microscopio óptico se utiliza sobre todo la parafina, y en menor medida la celoidina, como medio de inclusión.
La parafina es una sustancia de aspecto ceroso que está formada por mezclas de hidrocarburos saturados. A temperatura ambiente es sólida y su punto de fusión puede variar entre 40 °C y 70 °C según la composición de la mezcla de hidrocarburos. Así, parafinas más duras a temperatura ambiente tienen un punto de fusión mayor, mientras que las más blandas uno menor. Es recomendable una dureza mayor para incluir muestras más duras.
Las parafinas más usadas tienen un punto de fusión en torno a los 60 °C. Se puede modificar las características de las parafinas añadiendo sustancias para variar su dureza, viscosidad, fragilidad, etc
La parafina no es miscible con agua, mientras que todos los tejidos están formados principalmente por agua. Además, la mayoría de los fijadores son soluciones acuosas. Esto implica que para que la parafina líquida pueda penetrar completamente en el tejido ha de sustituirse el agua por un solvente orgánico. Esto se consigue mediante la deshidratación del tejido en alcoholes, normalmente etanol. La deshidratación debe ser completa porque de no ser así afectará a la infiltración posterior de la parafina. Posteriormente se transfiere el tejido a un líquido que es miscible tanto con el alcohol de 100° como con la parafina; denominado sustancia intermediaria, como es el benceno, xileno, tolueno o el óxido de propileno, entre otros.
Estas sustancias son normalmente aclarantes por lo que comprobando la translucidez de la pieza podemos cerciorarnos de la penetración de la sustancia intermediaria en el tejido.
El tiempo de incubación de la pieza en algunos de estos líquidos intermediarios como el tolueno o xileno no debe ser excesivo puesto que estas sustancias endurecen la pieza y crean problemas al hacer las secciones
Por último se pasa el tejido previamente licuada en una estufa regulada a la temperatura apropiada para dicho tipo de parafina. Se dan tres pasos por parafina líquida para favorecer una completa sustitución del líquido intermediario por la parafina. El tiempo que dura dichos pasos depende de lo volátil que sea el líquido intermediario y lo grande que sea nuestra pieza. Será mayor cuanto menos volátil es el líquido intermediario o mayor sea la muestra de tejido. Hay que tener en cuenta que un tiempo excesivo en parafina puede endurecer el tejido. Sin embargo, los efectos de una pobre infiltración pueden ser más perjudiciales que mantener mucho tiempo las muestras en parafina líquida. Tras el embebimiento completo de la muestra se vierte parafina líquida en un molde, se introduce la muestra y se coloca según la orientación deseada de corte y se deja solidificar a temperatura ambiente.
El dispensador es el equipo que se utiliza para incluir la muestra
En este proceso su objetivo es poner las diferentes muestras de tejidos en unos moldes metálicos rellenándolos líquido a una temperatura de 55-60 °C y luego son colocados en una cámara refrigerada a -4 °C, hasta que la parafina endurezca, listo para pasar a recibir los cortes.
En la rutina histológica se utilizan dos tipos de parafinas: Parafina Blanda, cuyo punto de fusión se encuentra entre los 42º y 46º C, se emplea durante la pre-impregnación con el propósito que los tejidos comiencen a infiltrarse rápidamente con esta parafina, debido a que tiene menor viscosidad. Posteriormente, las muestras se sumergen en un baño de Parafina Dura (punto de fusión: 56º – 58º C), cuyo grado de dureza en mayor y facilita el seccionamiento con micrótomo. Durante la inclusión en parafina, se debe recordar que la cara del espécimen que se desea observar al microscopio debe tomar contacto con el fondo del molde.
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