L’électrophorèse sur gel d’agarose est l’une des techniques les plus utilisées dans les laboratoires de biologie moléculaire. Grâce à l’électrophorèse, nous pouvons séparer les fragments d’ADN et d’ARN en fonction de leur taille et de leur charge, les visualiser au moyen d’une simple coloration et ainsi déterminer la teneur en acides nucléiques d’un échantillon.
Comment se déroule l’électrophorèse sur gel ?
Le gel d’agarose poreux est utilisé pour séparer des macromolécules de différentes tailles. Le gel est immergé dans une solution tampon dans une chambre d’électrophorèse. La chambre a deux électrodes – une positive et une négative – à ses deux extrémités.
Les échantillons sont chargés dans de minuscules puits sur le gel à l’aide d’une pipette. Une fois que les échantillons ont été complètement chargés, le courant électrique est appliqué. Maintenant, les molécules chargées présentes dans l’échantillon commencent à migrer à travers le gel vers les électrodes. Les molécules chargées négativement se déplacent vers l’électrode positive et les molécules chargées positivement migrent vers l’électrode négative.
La vitesse à laquelle chaque molécule se déplace à travers le gel est appelée sa mobilité électrophorétique et est principalement déterminée par sa charge nette et sa taille. Les molécules fortement chargées se déplacent plus rapidement que les molécules faiblement chargées. Les petites molécules courent plus vite, laissant derrière elles les plus grosses. Ainsi, une forte charge et une petite taille augmentent la mobilité électrophorétique d’une molécule, tandis qu’une faible charge et une grande taille diminuent la mobilité d’une molécule.
Lorsque la séparation est terminée, le gel est coloré avec un colorant pour révéler les bandes de séparation. Le bromure d’éthidium est un colorant fluorescent couramment utilisé en électrophorèse sur gel. Le gel est trempé dans une solution diluée de bromure d’éthidium puis placé dans un transilluminateur UV pour visualiser les bandes de séparation. Les bandes sont immédiatement inspectées ou photographiées pour référence future.
Qu’est-ce que la purification des protéines ?
La purification des protéines est une technique de laboratoire qui consiste en une série d’étapes, qui visent à isoler un seul type de protéine à partir d’un mélange complexe. Cette technique est essentielle pour la caractérisation de la fonction, de la structure et des interactions.
Le matériau de départ est généralement un tissu biologique ou une culture microbienne. Cette purification s’effectue en une succession d’étapes que l’on peut résumer :
- Extraire la protéine de la matrice qui la confine
- Séparez les parties protéiques et non protéiques du mélange
- Séparez la protéine désirée des autres protéines
Étapes de la purification d’une protéine
- Créer un extrait de protéines brutes : Les extraits de protéines intracellulaires brutes sont préparés en lysant des cellules, à l’aide de procédés chimiques ou mécaniques. Les protéines extracellulaires sont obtenues en centrifugeant la solution et en éliminant les cellules.
- Purification intermédiaire : Cela peut être fait en précipitant les protéines avec un sel hautement concentré tel que le sulfate d’ammonium. Les sels de protéines sont ensuite passés à travers une membrane semi-perméable dans une étape connue sous le nom de dialyse ou soumis à une chromatographie ou à une filtration d’exclusion sur gel.
- Purification finale : Elle est réalisée par chromatographie d’affinité, électrophorèse sur gel de polyacrylamide ou immunotransfert.
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