Dans les applications d’ingénierie des protéines impliquant la mutagenèse et l’expression de protéines à partir d’ADN recombinant, les gènes synthétiques offrent de nombreux avantages par rapport à l’utilisation de gènes clonés d’origine naturelle. En spécifiant avec précision la séquence de nucléotides, vous pouvez garantir l’utilisation optimale des codons pour l’hôte d’expression et vous pouvez incorporer des sites de restriction appropriés si nécessaire, ce qui facilite la mutagenèse et le sous-clonage en cassette.
La synthèse d’un gène même relativement petit a généralement été considérée comme une tâche difficile et fastidieuse, qu’il vaut mieux laisser aux laboratoires spécialisés. Cependant, des techniques basées sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR) ont été développées, offrant des avantages tels que :
- Économies de coûts.
- Économies de main-d’oeuvre.
- Le processus de synthèse des gènes est considérablement simplifié.
- Il a le potentiel pour la synthèse de gènes significativement plus grands que les techniques établies actuellement.
Applications de la PCR dans l’obtention d’oligonucléotides et de gènes synthétiques
Les gènes synthétiques sont assemblés par concaténation d’oligonucléotides plus courts. En général, les deux chaînes d’ADN sont entièrement synthétisées comme des oligonucléotides chevauchants courts qui se phosphorylent, hybrident et lient pour produire le produit de longueur complète. Le coût de la synthèse peut être réduit en synthétisant des oligonucléotides qui représentent la séquence partielle de chaque brin, et les trous dans le produit hybridé sont « remplis » en utilisant de l’ADN polymérase avant la ligature.
Dans la pratique, ces deux méthodes donnent un faible rendement de produit de longueur complète et nécessitent une amplification par clonage avant toute manipulation supplémentaire du gène synthétisé. Récemment, une procédure de PCR a été décrite, dans laquelle un oligonucléotide de 234 bases a été synthétisé chimiquement et des amorces ont été utilisées pour amplifier toute molécule de longueur complète résultant de la synthèse chimique.
Bien que cette procédure augmente efficacement la longueur de la séquence qui peut être synthétisée directement avec un rendement utile, la longueur est encore relativement courte par rapport à un gène structurel de taille modérée. Les gènes peuvent également être assemblés par la méthode de coupe et d’épissure par extension superposée, dans laquelle les produits PCR sont purifiés en les séparant de leurs amorces d’amplification et s’étendent les uns aux autres pour produire un produit plus grand. Ce produit est amplifié simultanément par l’inclusion d’amorces flanquantes plus petites.
Quelle est l’importance des oligonucléotides dans la biologie moléculaire ?
On peut dire à juste titre que les oligonucléotides synthétiques sont le carburant qui alimente le moteur de la biologie moléculaire. Par conséquent, disposer de moyens pour la synthèse de ces composés sont de plus en plus importants. Presque toutes les techniques actuellement utilisées en biologie moléculaire utilisent de l’ADN ou de l’ARN synthétisés chimiquement. Cela inclut :
- PCR.
- PCR en temps réel.
- Séquencement ADN.
- Mutagenèse dirigée vers le site.
- Essais de polymorphisme mono-nucléotide (SNP).
- Micromatrices.
- Le monde en expansion rapide des petits ARN.
Cependant, contrairement à d’autres réactifs, les oligonucléotides ne sont pas des articles qui peuvent être stockés, jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires. Chaque oligonucléotide est fabriqué sur mesure en fonction des besoins spécifiques du chercheur individuel et purifié en fonction de l’application pour laquelle il est destiné. Au cours des dernières années, les progrès réalisés dans les techniques chimiques de synthèse des oligonucléotides, ainsi que dans les technologies de purification et de contrôle de la qualité, ont conduit à des augmentations substantielles de la qualité et des performances et à des baisses substantielles des coûts.
Pour la PCR, la plupart des amorces sont comprises entre 20 et 28 mètres. Cela signifie qu’une synthèse standard sera entre 85% et 90% de longueur complète. La PCR est un processus très tolérant dans le sens où la masse écrasante de produit de longueur complète sera suffisante pour produire l’amplitude d’intérêt dans une masse tout aussi écrasante. Par conséquent, pour la PCR, il y a peu de besoin de purification au-delà du dessalage qui élimine les sels organiques générés lors du processus d’extraction finale.
Les thermocycleurs de Kalstein dans la synthèse des oligonucléotides
Les oligonucléotides sont essentiels au développement de la biologie moléculaire, et leur synthèse par PCR peut être réalisée à l’aide de thermocycleurs fiables, tels que ceux conçus par le fabricant d’équipement de Kalstein. Certains de ces ordinateurs sont équipés d’un écran tactile avec lequel vous pouvez programmer le travail ou sélectionner certaines des méthodes préconfigurées, qui peuvent être modifiées et chargées à l’aide d’un programme compatible. Sur les pages ICI et ICI, vous pouvez consulter les prix, les devis, les achats et d’autres détails techniques de ces équipements.