La microscopie à fluorescence est une forme particulière de microscopie optique. Il utilise la capacité des fluorochromes à émettre de la lumière après avoir été excité par une lumière d’une certaine longueur d’onde. Les protéines d’intérêt peuvent être marquées avec de tels fluorochromes par coloration d’anticorps ou marquage de protéines fluorescentes.
Il permet de déterminer la distribution d’une molécule unique, sa quantité et sa localisation au sein d’une cellule. De plus, des études de colocalisation et d’interaction peuvent être réalisées, en observant des concentrations ioniques à l’aide de colorants qui se lient de manière réversible, et des processus cellulaires tels que l’endocytose et l’exocytose peuvent être observés.
Un microscope à fluorescence est un microscope optique conventionnel auquel est ajouté un adaptateur de fluorescence, qui permet l’observation optique de l’échantillon de manière conventionnelle ainsi qu’avec un contraste de fluorescence.
Alors qu’un microscope conventionnel utilise la lumière visible, qui se situe entre 400 et 700 nanomètres pour éclairer et agrandir l’image d’un échantillon, le microscope à fluorescence, quant à lui, utilise une intensité lumineuse beaucoup plus élevée, ce qui excite les espèces marquées par fluorescence dans l’échantillon. .
Comment fonctionnent ces types de microscopes ?
Le microscope à fluorescence fonctionne, tout d’abord, en marquant l’échantillon d’intérêt avec une substance fluorescente, connue sous le nom de fluorophore, puis en étant illuminé à travers la lentille avec une lumière à haute énergie. La lumière sera absorbée par le fluorophore et provoquera l’émission de lumière de faible énergie et de grande longueur d’onde. Cette lumière fluorescente peut être séparée du rayonnement qui l’entoure à l’aide de filtres conçus pour cette longueur d’onde spécifique, permettant à l’observateur de ne visualiser que ce qui est fluorescent.
La fonction la plus basique est de permettre à la lumière excitée de rayonner sur l’échantillon, puis de séparer la lumière plus faible émise de l’image. Premièrement, le microscope est doté d’un filtre qui ne laisse passer qu’un rayonnement d’une longueur d’onde spécifique identique à celle du matériau fluorescent. Le rayonnement entre en collision avec les atomes de l’échantillon et les électrons sont excités à un niveau d’énergie plus élevé. Lorsqu’ils se détendent à un niveau inférieur, ils émettent de la lumière. Pour être détectable, c’est-à-dire visible à l’œil humain, la fluorescence émise par l’échantillon est séparée de l’excitation plus brillante avec un second filtre. Cela fonctionne grâce au fait que la lumière émise est de plus faible énergie et avec une longueur d’onde plus longue que celle utilisée pour l’éclairage.
Des molécules avec un fluorophore spécifique sont utilisées pour établir un diagnostic, de sorte que lorsque l’échantillon est illuminé, il peut être vu dans une couleur spécifique. Pour cela, des filtres spécifiques, appelés filtres d’excitation, sont utilisés pour sélectionner et éclairer l’échantillon avec une zone spécifique du spectre visible.
Quelles sont ses principales applications ?
Les applications de la microscopie à fluorescence sont nombreuses, notamment en biologie et en médecine :
- Marquage de molécules dans les cellules et les tissus pour leur caractérisation et identification.
- Etude des cellules normales et pathologiques.
- Études immunologiques.
- Minéralogie.
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