Chez l’homme, on a observé pour la première fois le lien génétique de certaines maladies, entre l’hémophilie liée au sexe et le daltonisme. Cependant, l’application des principes de liaison génétique au diagnostic a été limitée jusqu’à ce que la richesse des marqueurs génétiques présents dans l’ADN puisse être facilement détectée à l’aide de la molécule d’ADN elle-même. Deux types principaux de variation de l’ADN peuvent être détectés entre différents individus ou entre deux chromosomes homologues d’un même individu :
- Les substitutions d’un nucléotide unique peuvent remplacer une paire de bases (pb) par une paire de bases différente.
- Il peut également y avoir une différence dans le nombre de pb. Cette différence peut impliquer la suppression (ou l’insertion) d’un seul pb ou peut être plus étendue, impliquant des centaines ou des milliers de pb
La taille du génome humain (environ 3 milliards de pb) et la fréquence des variantes/délétions de la séquence laissent prévoir que le nombre total de variantes communes devrait être de l’ordre de dizaines de millions. En théorie, les marqueurs liés à n’importe quel gène de maladie peuvent être analysés par typage de l’ADN.
Cependant, comme les gènes de la maladie sont localisés par des marqueurs liés, cette approche de liaison pour le diagnostic génétique est rapidement dépassée par la typologie directe de l’ADN des mutations de la maladie elles-mêmes. Le diagnostic direct des mutations joue un rôle de plus en plus important dans le diagnostic génétique à mesure que de plus en plus de gènes de maladies sont isolés et que leurs mutations sont découvertes.
Certains marqueurs génétiques typiques utilisés dans le diagnostic
Les polymorphismes de longueur de fragments de restriction (RFLPs) ont été les premiers marqueurs décrits dans lesquels une variation de la structure d’une molécule d’ADN est détectée. La longueur d’un fragment de contrainte, générée lors de la coupure de l’ADN avec une enzyme de restriction (ER) donnée, varie si :
- La séquence de reconnaissance de l’enzyme a une substitution de nucléotides qui empêche la scission
- Le nombre de bases entre deux sites de coupe par l’EER varie en raison de l’insertion/suppression
Traditionnellement, les RFLP ont été détectés par l’hybridation de sondes d’ADN, radiomarquées au phosphore 32, aux Southern Blots de fragments de restriction séparés par électrophorèse sur gel d’agarose. L’une des premières applications des marqueurs RFLP dans les maladies héréditaires a été le diagnostic prénatal de l’anémie falciforme. Les autres marqueurs d’intérêt sont :
- Ministatellites: ils consistent en une séquence hypervariable « centrale » de 17-35 pb qui est présente comme un nombre variable de répétitions en tandem, (VNTR), donnant lieu à une région hautement polymorphe ou hypervariable (HVR). Un gène HVR proche de celui de l’a-globine a été utile pour le diagnostic de la polykytose rénale chez l’adulte.
- Microsatellites : il s’agit d’une répétition GT sur un brin et d’une répétition CA sur le brin complémentaire. Ces courtes tranches de microsatellites, d’environ 10 à 20 unités de répétition, varient d’un multiple de 2 pb entre les membres de chromosomes homologues. Ceci a été trouvé dans le gène de la dystrophine mutée à la fois dans la dystrophie musculaire Duchenne et dans la Becker.
Détection et visualisation des marqueurs génétiques
La détection de marqueurs génétiques pour la typologie de l’ADN pose deux problèmes. Dans le premier, il est nécessaire de visualiser la région d’intérêt particulier parmi les trois milliards de pb de l’ADN humain. Et deuxièmement, il est nécessaire de pouvoir distinguer entre des variantes légèrement différentes d’un même fragment d’ADN.
La visualisation est traditionnellement basée sur l’affinité exceptionnelle d’une molécule de sonde d’ADN monocaténaire par sa chaîne complémentaire. Les sondes d’ADN, radiomarquées au phosphore 32, ont été hybridées avec de l’ADN monocaténaire immobilisé sur des membranes de nitrocellulose ou de nylon, les bandes correspondant aux régions d’hybridation étant détectées par autoradiographie.
Une autre approche utilise la PCR pour amplifier des fragments spécifiques situés entre une paire d’amorces situées sur des brins opposés et complémentaires. Le produit peut être visualisé directement, suivi d’une électrophorèse sur un gel d’agarose contenant du bromure d’éthidium (EtBr). Lorsqu’il est irradié par une lumière ultraviolette, le colorant EtBr qui est lié à l’ADN produit une fluorescence jaune.
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